El cultivo de tejidos, es una técnica, que consiste esencialmente en aislar una porción de planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas para que las células expresen su potencial.
Un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales presenta varias áreas entre las cuales se destacan.
à Área de preparación; se utiliza para preparar los medios de cultivo, en este se almacenan materiales de vidrio y de plástico así como reactivos químicos.
à Área de lavado y de esterilización; puede estar constituida por dos áreas conectadas entre si. Esta debe incluir por lo menos un lavadero grande con agua caliente y fría y una fuente de agua de alto grado de pureza. En esta área se debe disponer de un espacio para almacenar agua destilada en botellas de plástico. Esta área debe tener un espacio para la autoclave vertical u horizontal, también se puede incluir el espacio para estufa, secadores y un lavadero con agua caliente y fría.
à Área de transferencia; aquí se realiza el trabajo de excusión, inoculación y transferencia de los explantes a los medios de cultivo. Se recomienda la instalación de gabinetes de flujo horizontal o vertical de aire filtrado bajo presión.
à Área de incubación; Esta área debe proporcionar un buen control de temperatura (20-28 oC), de iluminación (variable según las necesidades: 1000 a 5000 lux) y de humedad relativa (70%-80%).
à Área de observación y de examen; aquí se localizan microscopios. El objeto de esta área es realizar observaciones periódicas de los cultivos tanto en medios semisólidos como en líquidos.
à Área de crecimiento; Después del trasplante, las plantas generalmente necesitan un acondicionamiento gradual a las condiciones de campo, el cual se puede lograr con nebulización, cámaras húmedas de plástico etc.
à Área de cuarentena y de control fitosanitario; Esta área debe estar separada del resto del laboratorio. Por otra parte el área de control sanitario se realiza pruebas necesarias para comprobar la sanidad del material vegetal, como enfermedades causadas por virus, hongos y bacterias.
à Área de oficina; aquí se ubican escritorios, archivos y almacenamiento de datos, los libros de referencia y de control de laboratorio, los catálogos y otros documentos, así como equipo de computo.
En la actualidad existen innumerables formulaciones, para la preparación de los medios de cultivo, cada una de las cuales contiene entre 15 y 35 compuestos químicos que suministran:
à Carbono
à Nutrimentos minerales
à Vitaminas
à Agente gelificante
à Sustancias reguladoras de crecimiento
FUENTES DE CARBONO: Muy pocos de los medios de cultivo in vitro son autótrofos, y por lo tanto es necesario agregar al medio una fuente de carbono. La sacarosa es el azúcar que mas se utilizada, y se puede remplazar por glucosa y en menor medida por fructosa.
NUTRIMENTOS MINERALES: Cualitativamente los medios de cultivo aportan los mismos elementos (macro y micro nutrimentos) que se consideran esenciales para el crecimiento de las plantas enteras.
VITAMINAS: Son también empleadas por ellas para su crecimiento y diferenciación con papeles catalíticos en el metabolismo. Las vitaminas que son adicionadas más usualmente como parte del medio sintético son: tiamina-HCl, ácido nicotítico, piridoxina-HCl, biotina, ácido fólico, ácido pantoténico, riboflavina.
AGENTE GELIFICANTE: En los medios semisólidos comúnmente se le adiciona agar (0.6% a 1.0%). Se debe considerar especialmente la pureza del agar, la marca comercial y las concentraciones de agar utilizado pueden alterar las respuestas in vitro de los cultivos.
REGULADORES DE CRECIMIENTO: En algunos casos se obtienen en los cultivos in vitro las respuestas deseadas mediante el empleo del MS sin reguladores de crecimiento. Sin embrago en la mayoría de los casos se hace necesario agregar al medio sustancias reguladoras de crecimiento, generalmente del tipo auxinas o las citocininas. Estos compuestos por lo general se adicionan al medio ya que funcionan como hormonas. Haciendo que la planta desarrolle raíces, crecimiento vegetativo, etc.
La composición de una solución se debe medir en términos de volumen y masa, por lo tanto es indispensable conocer la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o masa de disolvente, es decir su concentración. Durante cualquier trabajo experimental, el uso de soluciones se hace indispensable, por lo que es necesario conocer los procedimientos para su elaboración.
Es necesario preparar el medio de cultivo utilizando agua destilada o agua desmineralizada-destilada. Todas las sustancias utilizadas para su preparación deben ser de un alto grado de pureza. El procedimiento para la preparación de los medios dependerá, en primera instancia, del tipo de medio, de su consistencia y de la presencia de compuestos termolábiles. En general se pueden distinguir:
Medios líquidos con sustancias termolábiles. Para su preparación se sigue el mismo del inciso a, pero sin adicionar agar, y haciendo la esterilización por filtración, en el caso de medios que contengan sustancias termolábiles.
Medios semisólidos con una o más sustancias termolábiles; para su preparación se siguieren las siguientes operaciones:
Los factores que intervienen en el proceso de esterilización son;
FISICOS
FISICOS
à Calor seco
Ã
à Calor húmedo bajo presión. A 121°C, con 15 PSI, por 20-25 min
à Filtración
QUIMICOS
à NaClO hipoclorito de sodio del 2-4%
à Oxido de etileno
à Ozono
à HgCl2 (bicloruro de mercurio) al 5%, para lavar maños y explantes
à H2O2. Para lavar material de metal
à Nitrato de plata
à Aldehído
à Bromuro de etilo, “fumigante”
à Alcohol al 70%
El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el propósito de transferir un tejido que crece activamente con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán a partir del explanto original dependen de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como tallos, raíces, bulbos u otros órganos. Los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o pueden colocarse en un medio líquido. Los tejidos también necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y una mezcla de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares.
Para el año de 1962 Musharigue propone 5 etapas para el cultivo de tejidos vegetales.
à ETAPA 0. Selección de plantas domadoras de explantes
à ETAPA 1. Siembra in-vitro: es cuando la planta se coloca en condiciones con mucha asepsia en un medio de cultivo.
à ETAPA2. Multiplicación ó subcultivo: es cuando se lleva a cabo el sub-cultivo (la multiplicación in vitro), es decir la micropropagación.
à ETAPA 3. Enraizamiento: es donde se lleva a cabo el enraizamiento de la planta, esta se saca del medio de cultivo y se coloca en una maceta.
à ETAPA 4. Adaptación a campo: esta etapa es la etapa final, en ella se lleva a cabo el trasplante de la planta directamente a campo.
Con la selección de plantas madre se pretende elegir a los individuos con características más deseables para que funjan como progenitores. Una buena selección de plantas madre orientadas a la producción, son aquellas plantas que han sido criadas y seleccionadas con la finalidad de poder obtener de ellas esquejes o clones idénticos que sean 100% viables para su producción; es decir, que las plantas o los tallos, que son capaces de formar nuevas raíces dan lugar a nuevos ejemplares (esquejes o clones) idénticos genéticamente a la planta original.
Las plantas madres deben ser identificadas y seleccionadas teniendo en cuenta los criterios siguientes:
à Tolerancia a plagas y enfermedades.
à Buena producción.
Es importante recalcar que los mejores resultados se obtienen de plantas sanas y seleccionadas por sus especiales características, con al menos dos meses de edad, y que no hayan sido refloradas. Las plantas hembras que han sido inducidas a florar y después a revegetar producen menos esquejes y de peor calidad, débiles y de lento enraizado.
En cuanto al tamaño del explante se ha postulado como regla general, que en la medida que el explante es mas pequeño, menor es su capacidad de supervivencia, lo cual es lógico, si se tiene en cuenta que un menor numero de células son las que deben asumir el crecimiento y que el estrés de separación del explante es mayor, cuando es mas pequeño. Este principio aplicable tanto a tejidos diferenciado como a callos, se ha manifestado en distintos ensayos.
Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependen de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales.
Para el explante de sebe considerar un tamaño aproximado de 3 Cm, ya que si el explante es demasiado grande será mas fácil su contaminación, también de sebe de considerar el tamaño del frasco. Por lo que debe de ser frascos anchos.
Para la Siembra del explante, en este proceso se toma un frasco con medio de cultivo se quita el sello, posteriormente se toma con una pinza (previamente esterilizada) el explante y se coloca dentro del medio de cultivo, esto cuidando que la yema quede hacia arriba,tomando en cuenta la polaridad de la planta madre; ya que puede llegar a suceder una polaridad invertida la cual va a depender de los ápices, raíces, hojas, semillas, tallos y yemas, en que se siembre la planta así. También es importante hacer esto cerca del fuego y no introducir la mano dentro del frasco con el medio de cultivo, es también de mucha importancia no colocar la tapa boca abajo ni tocar la parte interior de la misma. Una vez sembrado el explante se cierra fuertemente el frasco y de esterilizan de nuevo las pinzas para realizar el mismo procedimiento al sembrar el siguiente explante.
Condiciones de incubación
à Edad: plantas jóvenes.
à Posición de la planta.
à Sanidad: deben ser plantas sanas y bien nutridas
à Estado fenológico: fase vegetativa.
à Época del año: época de lluvia.
à Tipo: herbácea.
à Genética: se debe tomar la mejor variedad
Los cambios fisiológicos o sensibilidad dependen mucho de las condiciones en que se encuentre la planta, y se expresa como un cambio de comportamiento ocasionado por las condiciones de cultivo; estos cambios ocurren con frecuencia, y son revestidos cuando el cultivo se vuelve a poner en las condiciones originales. Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependen de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales.
à Parénquima desorganizado: provoca la pérdida de agua
à Raíces no funcionales al ser climatizadas.
à Vitrificación en plantas. Este procesó es irreversible, lo cual provoca la muerte de la planta.
à Cutina no uniforme.
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