Las técnicas de cultivo in vitro de tejidos aparecen en la actualidad como una alternativa para la conservación a corto, mediano y largo plazo. Esta última, implica la conservación de los explantes a temperaturas ultrabajas del nitrógeno líquido (-196ºC) y se denomina crioconservación. La crioconservación es una valiosa herramienta para conservar a largo plazo (años) nuestros recursos Fitogenéticos, ofreciendo la máxima estabilidad de los caracteres genotípicos del germoplasma conservado, así como mínimos requerimientos de espacio y mantenimiento. Actualmente se dispone de varias técnicas para la crioconservación de germoplasma vegetal, entre las cuales se encuentra la encapsulación-deshidratación. El uso de la crioconservación para el almacenamiento de germoplasma ofrecen varias ventajas en relación con las técnicas tradicionales, pues permiten la conservación a largo plazo (años), con bajos costos de mantenimiento, fácil manipulación de las muestras y no dependen del suministro eléctrico.
La crioconservación consta de seis pasos:
à Selección del material a crio conservar
Cuando se realiza la selección del material a crio conservar se debe tener la absoluta seguridad de que a partir del mismo se obtendrán plantas completas. El explante seleccionado dependerá del objetivo de conservación y está estrechamente relacionado con el tipo de propagación de la especie.
à Deshidratación
La deshidratación del explante es un paso crucial para el éxito de la crio-conservación, ya que es necesario eliminar toda el agua libre presente en el tejido vegetal, minimizando así posibles daños debidos a congelación. La deshidratación del tejido puede realizarse en una cámara a 0ºC o en cámaras herméticamente cerradas utilizando sustancias higroscópicas como silica gel o glicerol (5 - 20%), o sometiendo al explante a una corriente de aire en un flujo laminar de aire estéril.
à Aclimatación
La aclimatación puede realizarse en forma rápida o lenta. La aclimatación rápida consiste en colocar el explante directamente en nitrógeno líquido, con o sin la adición exógena de crioprotectores. La aclimatación lenta se realiza bajando gradualmente la temperatura (0.1-3ºC/min.). Este punto debe ser manejado cuidadosamente, pues una deshidratación excesiva de las células puede exponerlas a una alta concentración interna de solutos. Por esta razón, el material generalmente se congela lentamente, a una velocidad adecuada, hasta alcanzar una temperatura próxima a los -40 ºC. Luego se lleva directamente a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 ºC).
A fin de preparar (aclimatar) el explante para enfrentar las bajas temperaturas a las que será sometido, se utilizan sustancias crioprotectoras como azúcares (sacarosa, glucosa), alcoholes (glicerol, etileglicol, manitol y sorbitol), dimetilsulfóxido (DMSO) y polivinilpirrolidona (PVP). También pueden utilizarse soluciones de vitrificación, que son una combinación de varios crioprotectores tales como el PVS2, que está compuesto por 30% de glicerol, 15% de etilenglicol, 15% de DMSO y 0.04M de sacarosa. Tanto los crioprotectores como las soluciones de vitrificación actúan fundamentalmente como agentes anticongelantes, aumentando la viscosidad del tejido vegetal y reduciendo la permeabilidad de las células.
à Almacenamiento
De acuerdo al material vegetal que se utilice, se presentan dos grandes sistemas:
- Sistemas secos: comprenden todos aquellos tejidos vegetales endógenamente resistentes y tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratación.
- Sistemas hidratados: son todos aquellos tejidos vegetales no tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratación, por lo cual se requiere de una protección exógena. Esta protección puede lograrse a través del uso de crioprotectores o bien por la utilización de soluciones de vitrificación. Los sistemas secos, por tratarse de tejidos más resistentes, necesitan de una menor preparación para el almacenamiento y comprenden aquellas especies que habitan zonas frías y/o templadas. En cambio, los sistemas hidratados son más susceptibles a las bajas temperaturas y están representados por todas aquellas especies que habitan zonas tropicales y subtropicales, las cuales no están adaptadas para soportar temperaturas inferiores a 0ºC. Por este motivo estos tejidos deben ser protegidos exógenamente mediante el uso de crioprotectores.
à Descongelamiento y rehidratación
Cuando se desea recuperar el explante mantenido en nitrógeno líquido se puede realizar un descongelamiento rápido en baño de agua (generalmente 1-2 min. a 30-40 ºC) o en forma lenta, sometiendo al explante a la temperatura del laboratorio o a una corriente de aire en el flujo laminar de aire estéril.
à Test de viabilidad
Los test de viabilidad nos permiten comprobar la/s zona/s del tejido que ha/n muerto y cuál/es ha/n sobrevivido al frío. La evaluación de la viabilidad puede llevarse a cabo en forma visual, realizando el re-cultivo y determinando la capacidad de regeneración, utilizando TTC (cloruro de 2,3,5–Trifenil-Tetrazolio) que colorea el tejido que ha sobrevivido a la crioconservación o midiendo la conductividad eléctrica, que permite estimar el daño producido en las membranas celulares.
à Técnicas de almacenamiento del material a preservar
En la última década han surgido numerosas técnicas que combinan el uso de crioprotectores y de soluciones de vitrificación con técnicas de deshidratación y encapsulación, las cuales básicamente pueden resumirse en técnicas de:
- Encapsulación-deshidratación
- Vitrificación
- Encapsulación-vitrificación
- Desecación
- Precultivo
- Precultivo-desecación
- Gotita congelada.
à MROGINSKI, L.A., W.M. ROCA, K.K. KARTHA. 1991. Criopreservación del Germoplasma. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. Roca W.
à M. y L. A. Mroginski (eds.) CIAT (32) :715-730. ROCA, W.M., D.I. ARIAS y R. CHÁVEZ. 1991. Métodos de conservación in vitro de germoplasma. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. Roca, W.M. y L.A. Mroginski (eds.) CIAT (31) :697-714.
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